潜流库塘有10个月（9月除外）可以达到Ⅳ类水水质要求。

对疫情发生区，抓住越冬成虫出土盛期、一代和二代幼虫高峰期，选用呋虫胺、球孢白僵菌、苏云金杆菌等药剂进行防治，注意轮换用药，避免产生抗性。因地制宜、多措并举，科学开展疫情防控。

在播种期，因地制宜实施地膜覆盖技术，控制越冬成虫出土。资料来源：食品伙伴网。疫情传入风险区，重点监测马铃薯集中种植区、种薯繁育基地，以及蔬菜交易市场或集散地周边的寄主作物分布区。马铃薯甲虫是全国农业植物检疫性有害生物，对马铃薯生产安全构成严重威胁。实行轮作倒茬，清除天仙子、刺萼龙葵等野生寄主植物，减少发生区域。

吉林、黑龙江省要加大马铃薯种薯繁育基地检疫检查力度。利用马铃薯甲虫成虫假死性，在春季越冬成虫出土盛期，组织人工捕捉，并摘除有卵块的叶片。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系相关链接：氧化酶，硫化氢，尿素酶，硝酸盐。

因此最终选用木薯淀粉作为发酵培养基的碳源。利用MEGA9.0软件通过邻接法构建系统发育树(图3)，菌株MCDA02与Microbacteriumesteraromaticum亲缘关系最近，将菌株MCDA02鉴定为Microbacteriumesteraromaticum。目前尚未见酯香微杆菌产几丁质脱乙酰酶的报道。（3）发酵培养基无机盐对菌株MCDA02发酵产CDA的影响无机盐对菌株MCDA02生长的影响如图6，所选的9种不同的无机盐中，添加ZnSO4时该菌株产酶最高，紧接着是KH2PO4，其相对酶活达75％以上，添加CuSO4时相对酶活最低，不足25％。

因此最终选用ZnSO4为配制发酵培养基所用无机盐。该菌株在LB固体培养上培养48h后：黄色，不透明，表面光滑湿润，圆形，边缘齐整，中心稍突起，易挑取(图2a)。

2、菌株MCDA02的鉴定菌株MCDA02为革兰氏阴性短杆菌(图2b)，无芽孢。（3）发酵培养基起始pH对菌株MCDA02发酵产CDA的影响发酵培养基起始pH对菌株MCDA02生长的影响如图9，随着发酵培养基初始pH的升高，菌株产酶能力随之提升，pH为8.0时，产酶量达到最高。发酵时间处于48h～72h之间时，产酶量增长速度减缓。声明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。

发酵时间达到72h时产酶量达到最高点，发酵72h后菌株MCDA02产酶量开始下降。（2）发酵温度对菌株MCDA02发酵产CDA的影响发酵温度对菌株MCDA02生长的影响如图8，在30℃时菌株MCDA02产几丁质脱乙酰酶的量最高。3、发酵培养基成分对菌株MCDA02发酵产CDA的影响（1）发酵培养基碳源对菌株MCDA02产酶的影响碳源对菌株MCDA02发酵产酶的影响如图4，所选的8种不同的碳源中，木薯淀粉为碳源时该菌株产酶最高，其次为乳糖，其相对酶活也达到了70％以上，玉米淀粉相对酶活最低仅有10％。菌株MCDA0216SrDNA序列提交GenBank(登录号：MH454348)，BLAST比对后发现菌株MCDA02与Microbacteriumesteraromaticum的同源性最高。

pH继续升高，菌株MCDA02产酶量降低，pH为10.0时，菌株MCDA02相对酶活低至20％以下。4、发酵条件对菌株MCDA02发酵产CDA的影响（1）发酵时间对菌株MCDA02发酵产CDA的影响发酵时间对菌株MCDA02生长的影响如图7，发酵时间在36h～48h时，产酶量显著增加

2、实验方法（1）产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的筛选初筛：称取lg泥样，加入富集培养基，在30℃、180r／min培养72h。酶活性和催化-几丁质脱乙酰的测定按照报道的方法进行。

细菌产几丁质脱乙酰酶报道较少，且报道的菌株中大部分分泌的几丁质脱乙酰酶只催化寡聚几丁质脱乙酰。富集培养基：几丁质2.5g／L、K2HP040.7g／L、KH2P040.3g／L、MgS040.5g／L，陈海水配置，pH7.0。声明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，32个循环。（2）菌株MCDA02的鉴定根据伯杰氏细菌手册对MCDA02进行形态学及生理生化鉴定。将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，装液量20％、180r／min，在不同温度下培养72h，取样测定酶活力，确定最佳发酵温度。

将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，30℃、装液量20％、180r／min，调节发酵培养基不同初始pH，培养72h后测定酶活力，确定最佳培养基起始pH。将初筛得到的菌株接入种子培养液中，30℃摇床培养24h后，以1％的接种量接入发酵培养基，30℃培养72h，分别测定其酶活力。

目前报道的几丁质脱乙酰酶多产于真菌。复筛：将初筛得到的菌株分别接到种子液中，30℃、180r／min摇床培养24h，再以1％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，30℃、180r／min摇床培养72h，取上清为粗酶液并进行酶活力测定和催化-几丁质脱乙酰的测定。

PCR产物送至南京思普金公司测序。（5）响应面优化菌株MCDA02发酵产CDA发酵条件根据单因素实验结果，选取对产酶影响最显著的三个变量为因变量，进行三因素三水平响应面实验设计，优化发酵条件。

但是，化学法产物品质不受控制，并会引起严重的环境污染问题。3、数据处理与分析每组试验设置3组平行，重复试验3次，试验结果用平均值标准方差(n=3)表示，采用Origin2018作图，响应面采用DesignExpert10进行统计分析。二、结果与分析1、几丁质脱乙酰酶产生菌的筛选通过变色圈法总共筛选得到了3株有变色圈的菌株，将这些菌株进行划线分离纯化，保存于斜面培养基中，置于4℃冰箱保存。化学法利用浓碱热解处理几丁质，使其脱去其中的乙酰基，是工业上广泛使用的方法。

如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系相关链接：蛋白胨，富集培养基，硝基乙酰苯胺，壳聚糖。酶活单位(U)定义：在上述反应条件下每小时产生对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

分光光度计：杭州明基科学仪器有限公司。平板筛选培养基：几丁质2g／L、K2EHPO40.7g／L、KH2P040.3g／L、MgS040.5g/L、对硝基乙酰苯胺0.2g／L、琼脂20g／L，陈海水配置，pH7.0。

（4）单因素优化菌株MCDA02发酵产CDA发酵条件确定最佳发酵培养基后，将种子液以l％接种量接种至发酵培养基，30℃、装液量20％、180r／min发酵96h，每隔12h取样测酶活力，确定最佳发酵时间。将种子液以1％接种量接种至不同装液量发酵培养基，30V、180r／min，培养72h后测定酶活力，确定最佳装液量。

种子培养基：蛋白胨5g／L、酵母粉lg／L，陈海水配置，pH7.0。DK-8D电热恒温水槽：上海-恒科技有限公司。将种子液以不同接种量接种至装液量为20％的发酵培养基，30℃、180r／min，培养72h后测定酶活力，确定最佳接种量。几丁质是在自然界中含量仅次于纤维素的天然生物大分子，主要存在于海洋无脊椎动物、昆虫的壳及真菌的细胞壁。

SPX-250B-2生化培养箱：上海博迅实业有限公司。选取酶活力较高，并能催化几丁质脱乙酰的菌株进行进一步研究。

（3）单因素优化菌株MCDA02发酵产CDA培养基在原发酵培养基的基础上，保证接种量l％、30℃、装液量20％、180r／min发酵72h的发酵条件不变，改变培养基中的碳源：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、豌豆粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉，氮源：蛋白胨、尿素、牛肉膏、豆粕、玉米浆(干粉)、米糠、花生粕、麸皮、NaN03、NH4C1、(NH4)2S04，无机盐：MgS04、CuS04、CaCl2、NaH2P04、KH2P04、MnS04、ZnS04、BaCl2、FeCl3，分别取样测定酶活力，确定最佳碳源、氮源及无机盐。生物法，反应条件温和，催化过程易控，而且解决了化学法造成的环境污染问题，极具应用潜力。

SW-CJ-1D超净工作台：苏州净化设备有限公司。取富集培养液100uL均匀涂布于筛选培养基，30℃、培养3～5d，挑取周围出现明显黄色圈的菌落，在LB培养基中进一步划线纯化并保存。

(责任编辑：高人杰)